细胞与分子免疫学杂志

HDAC11通过抑制自噬促进ox-LDL诱导的小鼠巨噬细胞泡沫化

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶11(HDAC11)在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7泡沫化过程中的作用。方法 将小鼠巨噬细胞RAW264.7分为Control组、 ox-LDL组、 ox-LDL联合雷帕霉素(Rapamycin)组，油红O染色观察巨噬细胞泡沫化改变，酶标法检测RAW264.7细胞内总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的含量，Western blot法分析HDAC11、微管相关蛋白1轻链3BⅡ(LC3BⅡ)及p62蛋白表达；转染si-HDAC11至RAW264.7细胞，实时定量PCR和Western blot法检测巨噬细胞中HDAC11干扰效率；在使用ox-LDL处理的基础上，敲低RAW264.7细胞内HDAC11表达，油红O染色观察RAW264.7细胞内的脂滴含量，酶标仪检测TC、 TG的含量，Western blot法检测细胞内LC3BⅡ、 p62蛋白表达改变。结果相较于Control组，给予RAW264.7细胞ox-LDL处理后，LC3BⅡ蛋白表达明显降低，而p62及HDAC11蛋白水平显著增加，同时细胞内脂滴及TC、 TG含量明显增高；而同时给予自噬激动剂Rapamycin处理后，RAW264.7细胞内LC3BⅡ及p62蛋白表达及脂滴、 TC、 TG含量改变明显缓解；当转染si-HDAC11后，与ox-LDL联合si-NC组相比，巨噬细胞LC3BⅡ蛋白表达明显增加，p62蛋白水平降低，同时RAW264.7细胞内脂滴及TC、 TG含量亦显著降低。结论 HDAC11通过抑制自噬促进ox-LDL诱导的小鼠巨噬细胞泡沫化。

基于网络药理学探究黄芩素调控过敏性接触性皮炎机制

目的 阐释黄芩素治疗过敏性接触性皮炎(ACD)的潜在分子机制。方法 构建由肿瘤坏死因子α(TNF-α)与γ干扰素(IFN-γ)共同刺激人角质形成细胞(HaCaT)的体外炎症模型，实时定量PCR检测黄芩素对炎症因子的调控作用。网络药理学筛选黄芩素与ACD的共同靶点，通过蛋白互作网络(PPI)及通路富集分析预测关键信号通路，运用分子对接评估黄芩素与核心靶点的结合能力。结果 体外实验发现，黄芩素可显著降低TNF-α联合IFN-γ刺激诱导的HaCaT细胞促炎因子的表达，但对1型辅助T (Th1)/Th17细胞失衡无显著影响，提示其抗炎机制并非完全依赖于T细胞活化与Th17细胞分化等炎症通路。经网络药理学筛选后，共获得46个黄芩素治疗ACD的潜在靶点，并且功能富集指向T细胞活化与Th17细胞分化等炎症通路。进一步通过CytoHubba和MCODE算法从46个潜在靶点中获取到11个核心靶点。分子对接结果显示，黄芩素与细胞色素P450(CYP450)家族相关核心靶点具有高结合亲和力，其中与CYP1A1亲和力最高(结合能为-10.17 kcal·mol^-1, RMSD值为1.14)。结论 黄芩素治疗ACD潜力显著，可下调TNF-α联合IFN-γ诱导的HaCaT细胞炎症因子表达，其机制可能与调控CYP450家族相关靶点相互作用有关。

不同海拔环境暴露下H2-Eb1基因对变应性鼻炎的调控作用

目的 研究H2-Eb1基因在高原环境下对变应性鼻炎(AR)的调节作用，阐明急进高原和长期高原适应对AR的不同影响，为高原地区的AR预防和治疗提供依据。方法 通过卵清蛋白(OVA)腹腔注射和鼻滴法进行AR模型构建，将6～8周龄的C57BL/6雄性小鼠分为平原正常组、平原AR组、高原正常组、高原AR组、急进高原正常组、急进高原AR组、每组10只。平原组在海拔1500 m处饲养，高原组在模拟海拔7000 m的高压舱中饲养，急进高原组先进行致敏处理，然后转移到高压舱中1周，以观察鼻炎症状、鼻黏膜病理以及小鼠体内H2-Eb1 mRNA及蛋白表达情况。结果 所有AR组小鼠均出现鼻炎症状，其中急进高原组鼻炎症状最为严重，长期高原AR组症状最轻，并且高原AR组H2-Eb1基因蛋白表达量降低，炎症浸润情况得到改善，而急进高原AR组则情况相反。结论 急进高原暴露会上调H2-Eb1蛋白表达，从而加重急性高原反应；而长期适应高原环境则会下调该基因蛋白表达，这为调节高原急性反应提供了一个重要的调控靶点。

基于单细胞转录组数据解析肢端黑色素瘤肿瘤相关成纤维细胞的异质性特征

目的 探究肢端黑色素瘤(AM)中肿瘤相关成纤维细胞(CAF)的异质性特征及其在肿瘤微环境(TME)中的功能作用，为开发有效的治疗策略提供理论基础。方法 本研究使用的单细胞RNA测序数据由本课题组前期生成并已上传至国家基因组科学数据中心(NGDC)的HRA001804数据集。从该数据集中选取5例AM患者的样本数据进行分析，包括4例原发灶样本(PL1、 PL2、 PL4、 PL5)和1例淋巴结转移样本(LG2)。采用无监督聚类、拟时间轨迹分析、转录因子调控网络分析和细胞间通信分析等生物信息学方法进行数据挖掘。结果 从41960个高质量细胞中识别出三种CAF亚型：免疫调节型(iCAF)、肌纤维型(mCAF)和增殖型(pCAF)。拟时间轨迹分析显示mCAF位于分化起始端，iCAF和pCAF分布于不同终末分支。FOS样1,AP-1转录因子亚基(FOSL1)被鉴定为调控CAF向pCAF分化的关键转录因子，其共表达模块富集于p53信号通路、激活蛋白1(AP-1)转录因子网络和MYC原癌基因(MYC)介导的细胞增殖通路等。细胞通信分析推断了以iCAF为枢纽的相互作用网络，关键通路包括硫酸软骨素蛋白多糖4-(整合素α2+整合素β1)[CSPG4-(ITGA2+ITGB1)]信号通路、生长分化因子15-转化生长因子βⅡ型受体(GDF15-TGFBR2)信号通路、半乳糖凝集素9(LGALS9)-CD45/CD44信号通路和CD70-CD27信号通路。结论 AM中CAF具有高度异质性，FOSL1在CAF分化中起关键调控作用，CAF通过复杂的细胞间通信网络参与TME调控。这些发现为理解AM生物学特性和开发靶向治疗策略提供了重要依据。

TFEB核转位介导的GPX4溶酶体降解促进子痫前期滋养层细胞铁死亡的机制研究

目的 探讨转录因子EB(TFEB)核转位介导的谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)溶酶体降解在人胚胎滋养层细胞HTR8-S/Vneo铁死亡中的作用。方法 将HTR8-S/Vneo细胞分为正常组、缺氧组、缺氧联合si-NC组(细胞转染si-NC)、缺氧联合si-TFEB组(细胞转染si-TFEB)、缺氧和si-TFEB联合RSL3组(细胞转染si-TFEB并用铁死亡诱导剂RSL3处理)以及缺氧和si-TFEB联合PP242组(细胞转染si-TFEB并用溶酶体激活剂PP242处理)。采用CCK-8试剂盒、划痕实验、 Transwell^TM实验分别检测细胞活力、侵袭数量和迁移率。使用FerroOrange铁离子探针检测细胞中Fe²⁺的含量。利用DCFH-DA活性氧(ROS)荧光探针检测ROS水平。ELISA检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。Western blot法检测TFEB、磷酸化TFEB(p-TFEB)、 GPX4蛋白表达以及TFEB核转位情况。利用溶酶体绿色荧光探针检测细胞溶酶体荧光强度。结果 与正常组相比，缺氧组细胞活力、侵袭数量和迁移率显著减少，细胞中Fe²⁺水平、 ROS荧光强度、 LDH和MDA水平显著增加，SOD活性和GSH水平显著减低，TFEB、 p-TFEB蛋白表达显著增加，GPX4蛋白表达显著减少，TFEB发生核转位，溶酶体荧光强度增加。与缺氧联合si-NC组相比，缺氧联合si-TFEB组细胞活力、侵袭数量和迁移率显著增加，铁死亡水平降低，TFEB核转位被抑制，溶酶体荧光强度降低。与缺氧联合si-TFEB组相比，缺氧和si-TFEB联合RSL3组HTR8-S/Vneo细胞铁死亡各项指标被逆转。与缺氧联合si-TFEB组相比，缺氧和si-TFEB联合PP242组细胞铁死亡水平升高。结论 抑制TFEB核转位进而降低人胚胎滋养层细胞HTR8-S/Vneo铁死亡，其机制可能与抑制GPX4的溶酶体降解有关。

IGFBP-4通过Wnt/β-catenin通路抑制巨噬细胞M1型极化改善滑膜炎症

目的　本实验基于Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）通路探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-4（IGFBP-4）通过抑制滑膜巨噬细胞M1型极化改善骨关节炎（OA）滑膜炎症。方法　C57bl/6雄性小鼠膝关节腔内注射碘乙酸钠构建骨关节炎模型，关节腔内注射IGFBP-4过表达/敲减腺病毒载体进行干预。微型计算机断层扫描技术（Micro-CT）观察膝关节软骨下骨变化；HE染色观察膝关节滑膜病理形态；ELISA检测小鼠血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）水平；免疫荧光染色观察滑膜巨噬细胞M1型极化；实时荧光定量PCR和Western blot法检测滑膜IGFBP-4、β-catenin、环氧化酶2（COX2）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和CD86表达。脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞炎症模型，利用IGFBP-4蛋白和Wnt/β-catenin通路激动剂SKL2001进行干预。CCK-8法检测细胞活性；流式细胞术检测M1型极化；ELISA检测细胞培养上清TNF-α、IL-6水平；Western blot法检测细胞Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达。结果　OA组小鼠软骨下骨表面缺损，IGFBP-4过表达组骨表面缺损减轻，IGFBP-4敲减组缺损加重。OA组滑膜组织增生增厚明显，IGFBP-4过表达组滑膜组织增生增厚较少，IGFBP-4敲减组滑膜组织增生增厚程度严重。OA组小鼠滑膜组织F4/80和iNOS共定位表达高于Sham组；与OA组相比，IGFBP-4过表达组F4/80和iNOS共定位表达降低，IGFBP-4敲减组F4/80和iNOS共定位表达升高。OA组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平以及滑膜中β-catenin、COX2、iNOS和CD86表达高于Sham组；与OA组相比，IGFBP-4过表达组TNF-α、IL-1β水平以及β-catenin、COX2、iNOS和CD86表达明显降低，IGFBP-4敲减组上述因子表达明显升高。与Control组相比，LPS组细胞β-catenin、COX-2表达明显升高，M1型极化增多，TNF-α和IL-6水平升高；LPS联合IGFBP-4组细胞β-catenin、COX2表达，M1型极化以及TNF-α和IL-6水平低于LPS组、LPS和IGFBP-4联合SKL2001组；与LPS和IGFBP-4联合SKL2001组相比，LPS联合SKL2001组细胞β-catenin、COX2表达，M1型极化及TNF-α和IL-6水平升高。结论　IGFBP-4能显著抑制巨噬细胞M1型极化减轻滑膜炎症，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

胎盘间充质干细胞外泌体miR-144-3p对妊娠期糖尿病脐静脉血管内皮细胞功能紊乱的影响

目的 娠期糖尿病(GDM)与母体胎盘血管内皮功能长期障碍有关，且GDM患者胎盘间充质干细胞(hPDMSC)外泌体(PdE)与该病的进程息息相关。本研究旨在探讨miR-144-3p在GDM患者PdE中的表达及其对血管细胞功能紊乱的影响，并探讨可能得作用机制。方法 分离并收集正常妊娠患者及GDM患者PdE(Nor-PdE组及GDM-PdE组)，采用脂质体将anti-miR144-3p及阴性对照转染hPDMSC，收集PdE；将PdE与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养，实时定量PCR检测miR-144-3p表达；CCK-8法检测HUVEC活性，Transwell^TM法检测对细胞迁移的影响；基质胶小管形成实验检测对细胞成管能力的影响；生物信息学分析及双荧光素酶报告分析评估miR-144-3p与细胞因子信号抑制因子6(SOCS6)的靶向关系；Westernblot法检测SOCS6的表达水平。结果 成功分离正常妊娠患者及GDM患者PdE，且与Nor-PdE组相比，GDM-PdE组中miR-144-3p的表达水平明显增加。anti-miR-144-3p处理明显抑制PdE中miR-144-3p的表达水平。与Nor-PdE组相比，GDM-PdE处理可明显抑制HUVEC的活性、迁移及微管形成能力；抑制miR-144-3p的表达后，GDM-PdE对HUVEC的活性、迁移及微管形成能力的抑制效应明显降低。与Nor-PdE组相比，GDM-PdE处理后HUVEC中SOCS6转录水平增加；生物信息学及荧光素酶分析证实SOCS6是miR-144-3p的潜在靶分子。miR-144-3p下调明显增加GDM-PdE处理下HUVEC活性、迁移及微管形成能力，而靶向敲除SOCS6后GDM-PdEmiR-144-3p下调介导促血管形成能力明显降低。结论GDM中PdE异常高表达的miR-144-3p可通过靶向调控SOCS6参与血管内皮细胞功能紊乱，提示本研究可能为PdE在GDM的防治中提供新的治疗靶点。

血管性血友病因子-ADAMTS13-凝血酶敏感蛋白1轴在肾综合征出血热患者血浆中的动态变化及临床意义

目的 ?探讨肾综合征出血热（HFRS）患者血浆中血管性血友病因子（vWF）、其裂解蛋白酶含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶13（ADAMTS13）及凝血酶敏感蛋白1（TSP-1）的动态变化规律，并分析其与病情严重程度、凝血功能及肾功能损伤的相关性。方法 ?纳入50例HFRS患者（急性期或恢复期血浆样本共计99份）和8名健康对照（8份血浆样本），采用ELISA检测血浆vWF浓度、vWF抗原（vWF:Ag）、vWF胶原结合活性（vWF:CBA）、ADAMTS13及TSP-1水平，结合临床分期和病情严重程度进行组间比较，并分析其与白细胞计数、血小板计数、活化部分凝血活酶时间（APTT）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）等临床指标的相关性。结果 与健康对照组相比，HFRS患者血浆vWF含量、vWF:Ag水平、vWF:CBA活性及TSP-1浓度均显著升高，而ADAMTS13水平无显著变化。在病程中，急性期vWF:Ag水平显著高于恢复期，而TSP-1水平急性期较健康对照升高且恢复期较急性期进一步升高。重/危重组患者vWF:Ag水平明显高于轻/中型组。同时，HFRS患者病程中血浆vWF:CBA/vWF:Ag比值显著低于正常参考范围。相关性分析显示，vWF:Ag水平与白细胞计数呈正相关，与血小板计数呈负相关；vWF水平与APTT呈正相关，而ADAMTS13水平与APTT、BUN及Cr均呈负相关。结论 HFRS患者存在vWF-ADAMTS13-TSP-1轴的明显失衡，表现为vWF释放增加、功能结构异常，ADAMTS13水平未见显著变化及TSP-1代偿性上调。该失衡与疾病严重程度、凝血功能障碍及肾功能损伤密切相关，可能是导致HFRS出血与微血栓形成的重要分子机制之一，为临床评估病情及探索靶向干预策略提供了新的实验依据。

巨噬细胞迁移抑制因子在慢性高原病中的表达水平及意义

目的 探讨巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）在慢性高原病（CMS）患者及低氧暴露大鼠中的表达水平及临床意义。方法 收集CMS患者和健康人群的血常规数据，并用ELISA检测两组人群外周血血清MIF水平。另外建立模拟CMS的低氧暴露大鼠模型，通过ELISA检测大鼠外周血及骨髓上清液中的MIF水平，统计MIF与血红蛋白水平的相关性。结果 实验结果显示，CMS患者外周血中MIF水平较健康人群显著升高，动物实验进一步验证，低氧组大鼠外周血MIF水平显著高于常氧组，并且MIF水平与血红蛋白浓度呈正相关，但低氧组大鼠骨髓上清液中MIF水平较常氧组显著降低，并与血红蛋白浓度呈负相关。结论 MIF在CMS患者及低氧大鼠外周血高表达，提示MIF可能主要由骨髓红系细胞产生并释放入血，其水平可反映CMS红系增生程度，有望作为病情评估的潜在血清学标志物；骨髓上清液MIF降低提示其在局部微环境中快速释放与消耗，为阐明CMS炎症-低氧协同致病机制提供新依据。

敲低IL-1R8增强体外扩增NK细胞对肝细胞癌的抑制作用

目的白细胞介素1受体8（IL-1R8）在活化的自然杀伤（NK）细胞中显著高表达，可负调控NK细胞的抗肿瘤免疫应答。本研究通过敲低体外扩增NK细胞的IL-1R8基因，探讨其对肝细胞癌（HCC）体内外杀伤活性的调控作用。方法采用慢病毒shRNA技术敲低人体外扩增NK细胞的IL-1R8表达，通过实时定量PCR和Westernblot法验证基因敲低效率；台盼蓝染色检测NK细胞增殖能力，流式细胞术分析IL-1R8敲低前后NK细胞主要表型受体的表达差异；乳酸脱氢酶释放实验检测NK细胞对HCC的体外杀伤毒性；ELISA检测NK细胞杀伤过程中细胞因子和趋化因子的分泌水平；构建Huh-7肝癌皮下移植瘤小鼠模型，评价IL-1R8敲低NK细胞的体内抑瘤效应，并采用免疫组织化学染色检测肿瘤组织中NK细胞的浸润。结果敲低IL-1R8对NK细胞的增殖能力和主要细胞表型无明显影响；IL-1R8沉默可显著增强NK细胞对HCC的体外杀伤活性，并明显促进肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）、C-C基序趋化因子配体3（CCL3）和C-X-C基序趋化因子配体8（CXCL8）的分泌。体内实验显示，IL-1R8敲低NK细胞可有效抑制HCC移植瘤生长，并显著提升肿瘤组织中NK细胞的浸润水平。结论靶向敲低IL-1R8可显著增强NK细胞的体内外抗肝癌活性，为优化NK细胞肿瘤免疫治疗策略提供新的实验依据与研究方向。

溃疡性结肠炎发病机制中免疫因素的研究进展

溃疡性结肠炎是一种常见的慢性肠道疾病,近年来发病呈上升趋势,而其发病机制目前尚不明确。目前认为与多种因素有关。环境因素作用于遗传易感者,在肠道菌丛的参与下,启动肠道免疫和非免疫系统,发生免疫反应和炎症,从而出现临床症状。其中免疫异常被认为是溃疡性结肠炎发病的重要因素,主要包括自身抗体、细胞免疫、细胞因子、环氧合酶与基质金属蛋白酶、氧自由基和一氧化氮等。本文综述了溃疡性结肠炎免疫发病机制中的各种影响因素。

IL-6介导免疫炎性反应作用及其与疾病关系的研究进展

白细胞介素6(IL-6)在免疫系统中具有多效性和多功能性。IL-6主要由巨噬细胞产生,通过去除传染性病原体、诱导受损组织愈合、急性期免疫反应以及凝血级联反应从而执行保护功能。IL-6的表达调控严格遵循转录机制,但转录后机制失调后,持续产生的IL-6在自身免疫性疾病和慢性炎症中有重要作用。近年来,用人源化的抗IL-6受体抗体阻断IL-6能对疾病的治疗产生明显疗效,相关的分子靶向制剂也正在研究中。

Annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的比较

目的比较annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的优缺点。方法用DEX诱导胸腺细胞凋亡和H2O2诱导K562细胞系细胞凋亡,应用Hoechst33342/PI和annexin V-FITC/PI双色标记流式细胞术检测体系检测细胞凋亡情况。结果 Annexin V-FITC/PI双标记法能准确地反映2种模型中的细胞凋亡情况,与其检测原理一致;而Hoechst33342/PI双标记法虽能准确反映DEX诱导胸腺细胞的凋亡情况,但在检测H2O2诱导的K562细胞凋亡时,其早期凋亡细胞的分布与其检测原理明显不符。结论与annexin-V-FITC/PI双标记法相比,Hoechst33342/PI双标记法有一定的局限性。

当归多糖对细胞免疫功能的增进作用

目的:观察当归多糖(AP)对细胞免疫功能的影响。方法:用机械分散法制备小鼠单个脾细胞悬液,用MTT比色法检测脾细胞和T细胞的增殖。以免疫磁珠法从小鼠脾细胞中分离纯化T细胞后,用流式细胞术观察AP对CD4+T细胞比率的影响。结果:当归总多糖AP-0及其3个组分AP-1、AP-2和AP-3在30~100mg/L剂量的范围内,能显著促进脾细胞的增殖(P<0.01);其中组分AP-3能显著促进混合淋巴细胞和T细胞的增殖反应,显著增加培养的脾细胞中CD4+T细胞亚群的比率。结论:AP对细胞免疫功能具有增强作用,T细胞是当归多糖的靶细胞之一。

IL-10的双向免疫调节作用

传统观点认为,同一细胞因子的免疫生物学作用相对固定,间接和直接途径刺激免疫应答或抑制免疫应答,两者选其一,但新近有文献报道同一个细胞因子在不同微环境中可发挥截然不同的免疫生物学作用。此领域中,近来以细胞因子IL-10的双向免疫调节活性最受关注,多年来有关IL-10的负向调节作用及其应用研究不断取得进展,另一方面,其免疫刺激的作用及免疫生物学意义的研究也正逐渐深入,并由此猜测其可能是一种多能细胞因子。本文将结合最新文献,就IL-10正、负向调节的免疫学特性进行综述。

Annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的比较

目的比较annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的优缺点。方法用DEX诱导胸腺细胞凋亡和H2O2诱导K562细胞系细胞凋亡,应用Hoechst33342/PI和annexin V-FITC/PI双色标记流式细胞术检测体系检测细胞凋亡情况。结果 Annexin V-FITC/PI双标记法能准确地反映2种模型中的细胞凋亡情况,与其检测原理一致;而Hoechst33342/PI双标记法虽能准确反映DEX诱导胸腺细胞的凋亡情况,但在检测H2O2诱导的K562细胞凋亡时,其早期凋亡细胞的分布与其检测原理明显不符。结论与annexin-V-FITC/PI双标记法相比,Hoechst33342/PI双标记法有一定的局限性。

PD-1/PD-L1参与肿瘤免疫逃逸的研究进展

程序性死亡分子1及其配体(PD-1/PD-L1)是一对负性免疫共刺激分子,正常情况下,组织细胞表面的PD-L1与淋巴细胞表面的PD-1结合后,可抑制淋巴细胞功能,诱导活化的淋巴细胞凋亡,从而在自身免疫耐受及防止自身免疫性疾病中发挥重要作用。多种肿瘤细胞表面也表达PD-L1,肿瘤细胞表达的PD-L1,可与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1分子结合,抑制淋巴细胞的功能及细胞因子的释放,并诱导淋巴细胞凋亡,从而抵抗淋巴细胞的杀伤作用,最终导致肿瘤发生免疫逃逸。

小鼠骨髓来源巨噬细胞体外培养及极化相关实验方法的建立

目的建立小鼠骨髓来源巨噬细胞体外培养,并将其极化为M1和M2型巨噬细胞的方法。方法获取小鼠骨髓细胞,以GM-CSF诱导其中单核细胞向巨噬细胞分化发育,并辅以LPS和IFN-γ以及IL-4刺激巨噬细胞分别向M1型和M2型分化。采用流式细胞术、实时定量PCR和ELISA的实验检测极化后细胞内以及细胞培养上清中的标志性细胞因子如IL-12、IL-10、Arg1、Ym1、MMR等的表达情况。结果形态学观察发现骨髓获取的细胞经诱导分化后呈现巨噬细胞特征性的贴壁形态;流式细胞术行胞内染色表明,极化后的M1型与M2型巨噬细胞各自表达其特征性的细胞因子IL-12和Arg1;实时定量PCR和ELISA分别检测所培养细胞胞内以及培养上清中的细胞因子,结果表明所刺激的M1型巨噬细胞高表达IL-12、iNOS、TNF-α等炎性因子,而M2型巨噬细胞表达MMR、Arg1、Ym1等标志因子。结论建立了稳定的M1和M2型巨噬细胞体外培养体系。

类风湿关节炎发病机制及其治疗方法研究进展

红景天苷对小鼠腹腔巨噬细胞体外增殖、凋亡、吞噬、ROS和NO产生的影响

目的:研究红景天苷(Sal)对小鼠腹腔巨噬细胞体外增殖、凋亡、吞噬、胞内活性氧簇(ROS)及分泌一氧化氮(NO)的影响,初步探讨其对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节作用。方法:无菌分离小鼠腹腔巨噬细胞,并制备单细胞悬液,以不同终浓度(80μmol/L、160μmol/L及320μmol/L)的Sal和巨噬细胞共培养4 h,再以脂多糖(LPS)和γ-干扰素(IFN-γ)进行共刺激。利用MTT比色法检测Sal对巨噬细胞体外增殖的影响。用放线菌酮(CHX)诱导巨噬细胞凋亡,用Sytox G reen染色结合荧光酶标仪检测Sal对CHX诱导巨噬细胞凋亡的影响。用流式细胞术(FCM)检测Sal对巨噬细胞吞噬功能的影响。用2-7-二氯氢化荧光素乙二脂(H2DCFDA)染色法结合荧光酶标仪检测Sal对胞内ROS产生的影响;用G riess反应检测Sal对巨噬细胞分泌NO的影响。结果:MTT比色法检测显示,终浓度为80、160、320μmol/L的Sal均可显著促进LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞增殖(P<0.05)。荧光酶标仪检测Syto xG reen染色法的结果显示,160μmol/L的Sal可抑制CHX诱导的巨噬细胞凋亡(P<0.01)。FCM结果显示,各浓度的Sal均能促进单纯药物组和实验药物组LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞的吞噬功能(P<0.05)。用荧光酶标仪检测DH2DCFDA染色结果表明,各浓度的Sal对LPS+IFN-γ刺激的巨噬细胞胞内ROS的产生均具有显著的抑制作用(P<0.01)。Griess反应检测NO含量的结果显示,各浓度的Sal对LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞产生NO均具有促进作用(P<0.05)。结论:Sal对LPS和IFN-γ刺激的巨噬细胞增殖具有显著的促进作用,对CHX诱导的巨噬细胞凋亡具有显著的抑制作用,对静息态和活化态的巨噬细胞的吞噬功能均有增强作用,并能减少LPS和IFN-γ活化的巨噬细胞胞内ROS的产生;但能促进LPS和IFN-γ活化的巨噬细胞NO的分泌。