细胞与分子免疫学杂志

SOX4驱动CD4~+T细胞向免疫抑制表型分化

目的 探讨SRY-box转录因子4(SOX4)对CD4~+T细胞的分化以及氧化磷酸化(OXPHOS)代谢的影响。方法 磁珠分选健康人外周血来源的CD4~+T细胞，通过CD3和CD28抗体刺激2 d后，慢病毒感染CD4~+T细胞分别构建SOX4过表达(SOX4-OE)组和空载体(Vector)组，流式细胞术检测SOX4-OE组与Vector组CD4~+T细胞的表型分子[CD25、程序性死亡受体1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(OX-40)]、转录因子叉头盒P3(FOXP3)、胞内细胞因子[转化生长因子β1(TGF-β1)、白细胞介素10(IL-10)、 γ干扰素(IFN-γ)、 IL-4、 IL-17A]以及OXPHOS相关指标[三磷酸腺苷(ATP)、活性氧(ROS)、线粒体活性氧(mtROS)、线粒体质量、线粒体呼吸链复合物]的变化；RNA测序分析SOX4-OE组与Vector组CD4~+T细胞的差异基因并进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)、基因本体论(GO)、基因集富集分析(GSEA)等富集分析。结果 与Vector组相比，SOX4-OE组CD4~+T细胞的活化表型分子CD25、 GITR和抑制表型分子CTLA-4、 PD-1表达比例显著增加，OX-40比例无显著差异，转录因子FOXP3表达比例显著增加；SOX4-OE组CD4~+T细胞的胞内细胞因子TGF-β1、 IFN-γ、 IL-17A比例显著高于Vector组，而IL-10比例显著低于Vector组，IL-4比例无显著差异；RNA测序分析SOX4-OE组与Vector组CD4~+T细胞的差异基因，通过KEGG通路分析得到OXPHOS通路显著富集；GO分析显示差异基因在免疫反应的调控、有氧电子传递链、正向调控TGF-β的产生等途径显著富集；GSEA富集分析得到相较于Vector组，SOX4-OE组CD4~+T细胞的TGF-β受体复合物介导的信号通路以及Sma和Mad相关蛋白2(SMAD2)/SMAD3:SMAD4异聚体转录活性上调；随着SOX4表达水平升高，CD4~+T细胞的ATP、线粒体呼吸链复合物水平显著升高，ROS、 mtROS水平显著降低，线粒体质量无显著差异。结论 SOX4促进CD4~+T细胞向类似于可塑性调节性T细胞(Treg)的状态分化，影响与Treg抑制功能密切相关的表型分子的表达，并且增强其氧化磷酸化代谢。

基于细胞共培养模型探究单核细胞在汉滩病毒感染致血管内皮细胞损伤中的作用

目的 探讨单核细胞在汉滩病毒(HTNV)感染致血管内皮细胞功能异常中的作用及调控机制。方法 构建基于Transwell^TM小室的体外共培养模型[中层接种人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)、下层接种HEK293细胞、上层接种外周血单个核细胞(PBMC)或去除单核细胞的PBMC],采用贴壁法去除PBMC中的单核细胞并利用流式细胞术检测去除效果；Western blot法检测组织细胞中HTNV核衣壳蛋白(NP)表达以评估单核细胞对病毒复制水平的影响；进一步利用Bio Plex悬液芯片系统及流式细胞术分别检测共培养模型中细胞因子分泌及T细胞活化水平；采用跨膜电阻(TER)法检测去除单核细胞或添加抗肿瘤坏死因子α(TNF-α)中和抗体后HUVEC通透性；探究单核细胞是否可通过影响免疫微环境稳态进而加重HTNV感染后内皮细胞损伤。结果 去除单核细胞显著促进HEK293细胞及HUVEC中HTNV NP表达；同时，小室上层培养液中TNF-α、白细胞介素1β(IL-1β)、 IL-6等促炎细胞因子水平显著降低，且去除单核细胞的PBMC中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、 1型辅助T (Th1)、 Th2、 Th17细胞活化水平下降；单核细胞去除后HUVEC跨膜电阻值下降趋势减缓，而抗TNF-α中和抗体可逆转单核细胞介导的内皮通透性增加。结论 本研究在方法学上改良Transwell^TM实验，更好的模拟了在体环境中HTNV感染的进程，揭示了单核细胞在HTNV感染致血管内皮细胞损伤中核心的、具有双重性质的调控作用：既可抑制HTNV在组织细胞中的复制，又可通过分泌TNF-α等促炎细胞因子、促进T细胞活化，增加血管内皮通透性；干预TNF-α可显著缓解HTNV感染诱导的内皮细胞损伤。

黄芩苷体外抗沙眼衣原体活性及其机制研究

目的 探究黄芩苷体外对沙眼衣原体(CT)活性的抑制作用及对CT感染细胞焦亡的影响。方法 构建CT感染细胞模型，测定不同浓度黄芩苷对CT包涵体形成数量和感染性子代的影响；CCK-8试剂盒测定黄芩苷对HeLa细胞活力的影响，选择对宿主细胞无明显毒性的最佳黄芩苷浓度；通过撤药实验，分析黄芩苷不同作用时间对CT包涵体及感染性子代数量的影响；倒置显微镜观察各组细胞焦亡情况；Western blot法检测黄芩苷对CT感染细胞焦亡相关蛋白水平的影响。结果 黄芩苷对CT的生长呈浓度依赖性抑制。CCK-8细胞毒性测定结果显示，当浓度不高于90μmol/L时黄芩苷处理组的细胞活力超过90%,无明显宿主细胞毒性。随着黄芩苷作用时间的延长，其对CT的抑制效果越明显，说明具有时间依赖性。倒置显微镜观察到CT感染组细胞出现肿胀、气泡状突出的典型焦亡细胞特征，而黄芩苷处理组的细胞气泡状突出现象明显缓解。Western blot结果显示，黄芩苷能明显抑制CT感染细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、前体半胱天冬蛋白酶1(pro-caspase-1)、切割型半胱天冬蛋白酶1(cleaved-caspase-1)、消皮素D-N(GSDMD-N)及焦孔素E(GSDME)蛋白表达水平。结论 黄芩苷能有效抑制体外CT生长，其机制可能与调控NLRP3/caspase-1/GSDMD和GSDME介导的细胞焦亡通路有关。

基于网络药理学探讨新型助眠汤通过调控小胶质细胞活化治疗失眠的机制研究

目的 在前期临床研究证实新型助眠汤对老年失眠具有显著疗效的基础上，本研究采用网络药理学联合体外实验方法，探讨其通过调控小胶质细胞活化改善失眠的潜在机制。方法 通过TCMSP和HERB数据库筛选助眠汤的活性成分及潜在靶点，并与失眠及小胶质细胞活化相关靶点交集，构建蛋白质互作(PPI)网络。利用DAVID平台进行基因本体论(GO)功能和KEGG通路富集分析，预测其核心作用通路。实验部分采用脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞活化模型，通过ELISA、实时定量PCR及一氧化氮(NO)检测评估助眠汤含药血清对炎症因子表达及小胶质细胞活化标志物的调控作用。结果 共筛得助眠汤活性成分87个、预测靶点831个，其中62个与失眠及小胶质细胞活化密切相关。PPI和通路分析表明，其靶点主要富集于高级糖基化终产物-受体(AGE/RAGE)、Toll样受体(TLR)、Janus激酶/信号转导及转录激活因子(JAK/STAT)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)等经典神经炎症相关通路。体外实验结果显示，助眠汤含药血清显著抑制LPS诱导的白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和NO的表达，并降低了诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶2(COX-2)的mRNA水平，提示其通过抑制小胶质细胞活化和炎症反应改善失眠。IL-1β、IL-6、TNF-α及NO表达，同时下调iNOS和COX-2的mRNA及蛋白水平，提示其可有效抑制小胶质细胞活化及炎症反应。结论 新型助眠汤可能通过调控AKT等信号通路，抑制小胶质细胞促炎极化，减轻中枢神经炎症，进而发挥助眠作用。本研究揭示了该复方治疗失眠的潜在免疫机制，体现了中药多成分、多靶点调节神经炎症的新思路。后续研究可进一步解析关键活性成分及其作用靶点，并结合多组学技术完善机制图谱。

GalNAc-T4通过细胞外信号调节激酶1/2信号通路参与缺氧复氧诱导的高糖H9c2心肌细胞自噬机制研究

目的 探讨N-乙酰氨基半乳糖转移酶4(GalNAc-T4)对高糖(HG)环境下缺氧/复氧(H/R)导致的H9c2细胞损伤模型中线粒体自噬的影响，以及其对细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号的调控机制。方法 细胞实验分为：正常对照组(Control):细胞转染pc-NC;HG组：培养基中加入50 mmol/L葡萄糖，细胞转染pc-NC;HG联合H/R组：HG处理的同时，进行低氧培养6 h,细胞转染pc-NC;过表达组(pc):细胞在进行HG联合H/R处理的同时，细胞转染pc;ERK1/2激动剂表皮生长因子(EGF)组：细胞在进行HG联合H/R以及细胞转染pc处理的同时，细胞的培养基中添加20 ng/mL的EGF。检测各组细胞的增殖活性、凋亡率、线粒体膜电位、活性氧(ROS)和铁离子以及线粒体自噬的水平，检测细胞中GalNAc-T4、 ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、线粒体外膜转位酶20(TOM20)、线粒体内膜转位酶23(TIM23)、 B淋巴细胞瘤2(Bcl2)和Bcl2相关X蛋白(BAX)的表达。结果 过表达GalNAc-T4,能明显升高HG联合H/R中的H9c2细胞增殖活性、线粒体膜电位以及细胞中TOM20、 TIM23和Bcl2的表达，降低细胞的凋亡率、 ROS以及铁离子水平，抑制线粒体自噬，下调细胞中p-ERK1/2/ERK1/2和BAX的表达，EGF可部分逆转过表达GalNAc-T4对心肌细胞的保护作用，差异均具有统计学意义。结论过表达GalNAc-T4后，能明显改善高糖环境下缺氧复氧H9c2细胞的线粒体的功能障碍，抑制氧化应激以及过度的线粒体自噬，降低心肌细胞的凋亡率，这可能与其能抑制ERK1/2信号的激活有关。

小鼠抗人腺病毒55型纤突蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备针对人腺病毒55型纤突蛋白（HAdV55Fiber）的鼠源特异性单克隆抗体。方法 采用基因合成技术，成功构建原核表达载体pET28a-HAdV55Fiber、真核表达载体pCAGGS-HAdV55Fiber。再将重组质粒pET28a-HAdV55Fiber转化至感受态BL21(DE3)后，使用AKTA纯化系统对异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达的蛋白进行纯化。采用拔罐法将pCAGGS-HAdV55Fiber质粒免疫BALB/c小鼠，基础免疫3次，间隔21d；以纯化Fiber蛋白经腹腔加强免疫2次。末次免疫后3d，通过将高效价脾细胞与SP2/0细胞进行融合，并采用有限稀释法筛选，成功获得针对Fiber蛋白的单克隆抗体，并对其亚型及腹水效价进行鉴定。采用免疫荧光法检测单克隆抗体对pCAGGS-HAdV55Fiber转染BHK-21细胞中表达Fiber蛋白的反应性。以课题组前期制备的HAdV55六邻体（Hexon）的单克隆抗体作为捕获抗体，HRP标记上述Fiber抗体为检测抗体进行筛选能够较好检测出HAdV55的抗体对。结果 成功构建了pET28a-HAdV55Fiber和pCAGGS-HAdV55Fiber表达质粒；IPTG成功诱导pET28a-HAdV55Fiber在BL21（DE3）中表达Fiber蛋白，并获得了纯化的Fiber蛋白；筛选过程中得到了5株杂交瘤细胞株，能稳定分泌抗Fiber蛋白单克隆抗体，其中2A4F3可识别真核细胞表达的Fiber蛋白；确定了以抗Hexon蛋白单克隆抗体2D3为捕获抗体、抗Fiber蛋白单克隆抗体2A4F3为检测抗体的抗体对，可通过双抗体夹心ELISA法检测HAdV55。结论 本研究成功制备了抗HAdV55 Fiber蛋白的特异性抗体，并初步建立了HAdV55的特异性检测方法。

整合素β3过表达细胞系的制备及其对汉滩病毒感染与复制能力的影响

目的 构建稳定过表达汉滩病毒（HTNV）受体整合素β3（ITGB3）的细胞系，以克服HTNV在常规培养细胞中扩增效率低、滴度不足的问题。方法 通过构建ITGB3的过表达慢病毒载体，利用慢病毒包装系统产生病毒颗粒，感染VeroE6和A549细胞，经嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞株。采用CCK-8法评估细胞增殖活性，通过实时定量PCR、Westernblot法及免疫荧光技术检测ITGB3的表达水平；接种HTNV后，进一步利用上述方法测定病毒RNA载量、核蛋白（NP）表达水平及病毒滴度变化。结果ITGB3在VeroE6和A549细胞中实现高效稳定过表达，且对细胞活力无显著影响。HTNV感染后，ITGB3过表达组的病毒RNA复制水平和NP蛋白表达均显著上调，病毒滴度明显高于对照组。结论 成功构建ITGB3稳定过表达细胞系，可有效促进HTNV的复制与扩增，为汉滩病毒的基础研究及抗病毒药物的开发提供了可靠的实验平台。

来特莫韦在异基因造血干细胞移植中的双重作用

人巨细胞病毒（HCMV）感染是异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后最常见且最严重的病毒感染并发症之一，显著增加移植物抗宿主病（GVHD）和非复发死亡风险。来特莫韦作为首个靶向HCMV病毒末端酶复合物的抑制剂，通过阻断病毒DNA的切割与包装，在移植后早期HCMV预防中展现出卓越疗效，能显著降低临床显著性HCMV感染（csCMVi）的发生率，并间接改善无GVHD无复发生存。然而，其强效的病毒抑制也带来双重作用：在带来临床获益的同时，也因限制了病毒抗原暴露，导致HCMV特异性T细胞与自然杀伤（NK）细胞的免疫重建延迟，进而增加了停药后晚发性HCMV再激活的风险，并可能与EB病毒再激活及移植后淋巴细胞增殖性疾病（PTLD）的风险升高相关。本文旨在系统综述来特莫韦在allo-HSCT中的双向作用，深入剖析其药理学机制、临床疗效、对免疫重建的影响及其潜在后果，并探讨基于免疫监测的个体化全程管理策略，以期为优化临床实践提供理论依据。

江苏地区献血人群HNA-1～-5基因型和基因频率的研究

目的 本研究探讨江苏地区献血人群人类中性粒细胞抗原（HNA）-1～-5等位基因的基因型和基因频率的分布特征。方法 收集健康献血者的抗凝血液样本300例，提取基因组DNA。采用优化的序列特异性引物聚合酶链式反应-序列特异性引物法（PCR-SSP）对所有样本进行扩增统计结果，随机抽取部分结果进行测序验证; 对筛查结果进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。采用聚合酶链式反应-直接测序法（PCR-SBT）和聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法（PCR-RFLP）对筛选出的HNA-1 null进行确认。结果 HNA-1a、HNA-1b和HNA-1c的等位基因频率分别为58.6%、41.4%和0，筛选出的2例HNA-1 null确认为免疫球蛋白G Fc段受体Ⅲb（FCGR3B）基因完全缺失。编码HNA-2的CD177基因频率为100%，未发现c.787 A>T纯合突变（TT）导致的HNA-2 null。HNA-3a、HNA-3b、HNA-4a、HNA-4b、HNA-5a、HNA-5b的等位基因频率分别为63.0%、37.0%、100%、0%、88.8%和11.2%。江苏与上海、浙江的HNA基因频率无统计学差异，与广州地区仅HNA-1a/1a（P=0.008）、HNA-3a/3a（P=0.033）、HNA-3b/3b（P=0.022）有统计学差异。结论 本研究获得的江苏地区HNA基因型和基因频率，为HNA引起的相关同种免疫的研究提供了基础数据。优化了适用于大规模筛查HNA的实验方法构建完整的HNA-1 null确证试验，为HNA-1 null 的后续研究提供了实验基础。

基于细胞成像技术的西部马脑炎病毒中和抗体评价方法的建立

目的 基于细胞成像技术建立一种快速、高通量及可视化的西部马脑炎病毒(WEEV)中和抗体评价方法。方法 首先利用幼仓鼠肾细胞(BHK-21)扩增本课题组前期构建的重组病毒rVSV-WEEV-GFP并进行滴定。然后基于高通量细胞微孔板成像系统(Cytation5)对BHK-21、非洲绿猴肾细胞(Vero)和小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro2a)三种细胞系感染rVSV-WEEV-GFP后进行荧光强度检测，确定rVSV-WEEV-GFP感染效率较好的细胞系；分析rVSV-WEEV-GFP感染细胞在不同时间点、不同感染复数(MOI)、不同细胞密度下平均荧光强度值，以此优化并确定最佳检测条件，从而建立基于细胞成像技术的中和抗体检测方法。进一步利用该方法与传统的空斑减少中和试验(PRNT)对1株广谱中和抗体分别进行50%抑制浓度(IC₅₀)测定，分析两种方法的一致性。最后利用该中和抗体评价方法对实验室前期制备的脑炎甲病毒抗体的中和活性进行评价。结果 Vero 细胞为rVSV-WEEV-GFP感染效率较高的细胞系；最佳检测时间和MOI分别是36 h和0.0625；最佳细胞数为每孔1万个细胞；基于细胞成像技术的中和抗体检测方法和PRNT方法具有高度一致性；6株抗体中有2株抗脑炎甲病毒的抗体对于WEEV具有较好的中和活性。结论 本研究建立的基于细胞成像技术的中和抗体评价方法为筛选WEEV高中和活性抗体奠定了良好基础。

溃疡性结肠炎发病机制中免疫因素的研究进展

溃疡性结肠炎是一种常见的慢性肠道疾病,近年来发病呈上升趋势,而其发病机制目前尚不明确。目前认为与多种因素有关。环境因素作用于遗传易感者,在肠道菌丛的参与下,启动肠道免疫和非免疫系统,发生免疫反应和炎症,从而出现临床症状。其中免疫异常被认为是溃疡性结肠炎发病的重要因素,主要包括自身抗体、细胞免疫、细胞因子、环氧合酶与基质金属蛋白酶、氧自由基和一氧化氮等。本文综述了溃疡性结肠炎免疫发病机制中的各种影响因素。

IL-6介导免疫炎性反应作用及其与疾病关系的研究进展

白细胞介素6(IL-6)在免疫系统中具有多效性和多功能性。IL-6主要由巨噬细胞产生,通过去除传染性病原体、诱导受损组织愈合、急性期免疫反应以及凝血级联反应从而执行保护功能。IL-6的表达调控严格遵循转录机制,但转录后机制失调后,持续产生的IL-6在自身免疫性疾病和慢性炎症中有重要作用。近年来,用人源化的抗IL-6受体抗体阻断IL-6能对疾病的治疗产生明显疗效,相关的分子靶向制剂也正在研究中。

当归多糖对细胞免疫功能的增进作用

目的:观察当归多糖(AP)对细胞免疫功能的影响。方法:用机械分散法制备小鼠单个脾细胞悬液,用MTT比色法检测脾细胞和T细胞的增殖。以免疫磁珠法从小鼠脾细胞中分离纯化T细胞后,用流式细胞术观察AP对CD4+T细胞比率的影响。结果:当归总多糖AP-0及其3个组分AP-1、AP-2和AP-3在30~100mg/L剂量的范围内,能显著促进脾细胞的增殖(P<0.01);其中组分AP-3能显著促进混合淋巴细胞和T细胞的增殖反应,显著增加培养的脾细胞中CD4+T细胞亚群的比率。结论:AP对细胞免疫功能具有增强作用,T细胞是当归多糖的靶细胞之一。

Annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的比较

目的比较annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的优缺点。方法用DEX诱导胸腺细胞凋亡和H2O2诱导K562细胞系细胞凋亡,应用Hoechst33342/PI和annexin V-FITC/PI双色标记流式细胞术检测体系检测细胞凋亡情况。结果 Annexin V-FITC/PI双标记法能准确地反映2种模型中的细胞凋亡情况,与其检测原理一致;而Hoechst33342/PI双标记法虽能准确反映DEX诱导胸腺细胞的凋亡情况,但在检测H2O2诱导的K562细胞凋亡时,其早期凋亡细胞的分布与其检测原理明显不符。结论与annexin-V-FITC/PI双标记法相比,Hoechst33342/PI双标记法有一定的局限性。

IL-10的双向免疫调节作用

传统观点认为,同一细胞因子的免疫生物学作用相对固定,间接和直接途径刺激免疫应答或抑制免疫应答,两者选其一,但新近有文献报道同一个细胞因子在不同微环境中可发挥截然不同的免疫生物学作用。此领域中,近来以细胞因子IL-10的双向免疫调节活性最受关注,多年来有关IL-10的负向调节作用及其应用研究不断取得进展,另一方面,其免疫刺激的作用及免疫生物学意义的研究也正逐渐深入,并由此猜测其可能是一种多能细胞因子。本文将结合最新文献,就IL-10正、负向调节的免疫学特性进行综述。

Annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的比较

目的比较annexin V-FITC/PI双标记与Hoechst33342/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡的优缺点。方法用DEX诱导胸腺细胞凋亡和H2O2诱导K562细胞系细胞凋亡,应用Hoechst33342/PI和annexin V-FITC/PI双色标记流式细胞术检测体系检测细胞凋亡情况。结果 Annexin V-FITC/PI双标记法能准确地反映2种模型中的细胞凋亡情况,与其检测原理一致;而Hoechst33342/PI双标记法虽能准确反映DEX诱导胸腺细胞的凋亡情况,但在检测H2O2诱导的K562细胞凋亡时,其早期凋亡细胞的分布与其检测原理明显不符。结论与annexin-V-FITC/PI双标记法相比,Hoechst33342/PI双标记法有一定的局限性。

PD-1/PD-L1参与肿瘤免疫逃逸的研究进展

程序性死亡分子1及其配体(PD-1/PD-L1)是一对负性免疫共刺激分子,正常情况下,组织细胞表面的PD-L1与淋巴细胞表面的PD-1结合后,可抑制淋巴细胞功能,诱导活化的淋巴细胞凋亡,从而在自身免疫耐受及防止自身免疫性疾病中发挥重要作用。多种肿瘤细胞表面也表达PD-L1,肿瘤细胞表达的PD-L1,可与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1分子结合,抑制淋巴细胞的功能及细胞因子的释放,并诱导淋巴细胞凋亡,从而抵抗淋巴细胞的杀伤作用,最终导致肿瘤发生免疫逃逸。

红景天苷对小鼠腹腔巨噬细胞体外增殖、凋亡、吞噬、ROS和NO产生的影响

目的:研究红景天苷(Sal)对小鼠腹腔巨噬细胞体外增殖、凋亡、吞噬、胞内活性氧簇(ROS)及分泌一氧化氮(NO)的影响,初步探讨其对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫调节作用。方法:无菌分离小鼠腹腔巨噬细胞,并制备单细胞悬液,以不同终浓度(80μmol/L、160μmol/L及320μmol/L)的Sal和巨噬细胞共培养4 h,再以脂多糖(LPS)和γ-干扰素(IFN-γ)进行共刺激。利用MTT比色法检测Sal对巨噬细胞体外增殖的影响。用放线菌酮(CHX)诱导巨噬细胞凋亡,用Sytox G reen染色结合荧光酶标仪检测Sal对CHX诱导巨噬细胞凋亡的影响。用流式细胞术(FCM)检测Sal对巨噬细胞吞噬功能的影响。用2-7-二氯氢化荧光素乙二脂(H2DCFDA)染色法结合荧光酶标仪检测Sal对胞内ROS产生的影响;用G riess反应检测Sal对巨噬细胞分泌NO的影响。结果:MTT比色法检测显示,终浓度为80、160、320μmol/L的Sal均可显著促进LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞增殖(P<0.05)。荧光酶标仪检测Syto xG reen染色法的结果显示,160μmol/L的Sal可抑制CHX诱导的巨噬细胞凋亡(P<0.01)。FCM结果显示,各浓度的Sal均能促进单纯药物组和实验药物组LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞的吞噬功能(P<0.05)。用荧光酶标仪检测DH2DCFDA染色结果表明,各浓度的Sal对LPS+IFN-γ刺激的巨噬细胞胞内ROS的产生均具有显著的抑制作用(P<0.01)。Griess反应检测NO含量的结果显示,各浓度的Sal对LPS+IFN-γ刺激巨噬细胞产生NO均具有促进作用(P<0.05)。结论:Sal对LPS和IFN-γ刺激的巨噬细胞增殖具有显著的促进作用,对CHX诱导的巨噬细胞凋亡具有显著的抑制作用,对静息态和活化态的巨噬细胞的吞噬功能均有增强作用,并能减少LPS和IFN-γ活化的巨噬细胞胞内ROS的产生;但能促进LPS和IFN-γ活化的巨噬细胞NO的分泌。

小鼠骨髓来源巨噬细胞体外培养及极化相关实验方法的建立

目的建立小鼠骨髓来源巨噬细胞体外培养,并将其极化为M1和M2型巨噬细胞的方法。方法获取小鼠骨髓细胞,以GM-CSF诱导其中单核细胞向巨噬细胞分化发育,并辅以LPS和IFN-γ以及IL-4刺激巨噬细胞分别向M1型和M2型分化。采用流式细胞术、实时定量PCR和ELISA的实验检测极化后细胞内以及细胞培养上清中的标志性细胞因子如IL-12、IL-10、Arg1、Ym1、MMR等的表达情况。结果形态学观察发现骨髓获取的细胞经诱导分化后呈现巨噬细胞特征性的贴壁形态;流式细胞术行胞内染色表明,极化后的M1型与M2型巨噬细胞各自表达其特征性的细胞因子IL-12和Arg1;实时定量PCR和ELISA分别检测所培养细胞胞内以及培养上清中的细胞因子,结果表明所刺激的M1型巨噬细胞高表达IL-12、iNOS、TNF-α等炎性因子,而M2型巨噬细胞表达MMR、Arg1、Ym1等标志因子。结论建立了稳定的M1和M2型巨噬细胞体外培养体系。

类风湿关节炎发病机制及其治疗方法研究进展